BİZDEN HABERLER
Yrd Doç. Dr. Evrim Ünsal
Yrd Doç. Dr. Evrim Ünsal

Yard. Doç. Dr. Evrim Ünsal

Mikrogen Genetik Tanı Merkezi / Ankara

Yıllardır kompetan embriyo seçimi morfolojik kriterlere göre yapılmaya çalışılmakta olup en yüksek implantasyon oranları hedeflenmiştir. Ancak çok iyi kalite embriyo transferi ile dahi pek çok kadın gebe kalamamaktadır. Bunun en önemli sebeplerinden biri bu morfolojik olarak normal görünümlü embriyoların anöploid olmasıdır.Morfoloji ile embriyo seçimi arasındaki bu zayıf korelasyon embriyonun transfer öncesi sayısal kromozomal oluşumunu gösteren PGS yöntemini doğurmuştur. PGS önceleri ileri anne yaşı, tekrarlayan IVF başarısızlığı, tekrarlayan düşükler (1) için uygulama alanı bulmuş bir tarama yöntemiyken anormal embriyo transferinden kaynaklanabilecek başarısız IVF uygulamasının yan etkilerini ortadan kaldırmak için de uygulanır hale gelmiştir. Önceleri PGS’in  zayıf klinik performans göstermesi  FISH tekniğinin sadece belli bazı kromozomları taraması sebepli olup ilk detaylı kromozom taraması çalışmaları preimplantasyon embryolarında anöploidinin 24 kromozomun herhangi birinde  görülebileceğini ortaya koymuştur. Bu da embriyonun kromozomal olarak normal olduğunu söyleyebilmek için 24 kromozomun taranması gerektiğini göstermektedir. Dolayısıyla FISH analizi ile gerçekleştirilmiş PGS’in etkinliğinin düşük olduğu bildirilmiştir. Aynı zamanda torfektoderm biyopsisi uygulamalarının artması PGS’te mozaisizmi ekarte etmede ve gelişimsel olarak kendini ispatlamış hücreler üzerinden yapılan testler sonucu elde edilen gebelik oranlarını da arttırmıştır.

 

Preimplantasyon embriyo biyopsilerine blastomer ve trofektoderm hücreleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak klivaj embriyolarının %60’ı mozaisizm gösterdiğinden hatalı pozitif ya da hatalı negatif sonuç verme ihtimalini doğurmaktadır. Ayrıca klivaj aşamasında anöploid olarak değerlendirilen çoğu embriyonun self correction sayesinde blastokist aşamasında öploid olduğu görülmüştür. Bu da gelişimin erken döneminde embriyoyu hatalı diye etiketlediğimiz için uygulamanın canlı doğum şansını da azaltmaktadır (2). Mozaisizm blastokistlerde de olmaktadır ancak klivaj embriyolarına nazaran oranı düşüktür. Johnson un çalışmasında iç hücre kitlesi ve trofektoderm arasında ve trofektoderm fraksiyonları arasındaki mosaisizm oranı %4 olarak bildirilmiştir (3). Aynı zamanda blastokist hücrelerinde görülen anöploidi oranı da erken embriyonun önceki aşamalarına nazaran oldukça düşüktür. Beşinci gün embriyosunda embriyo oluşumuna katılmayan hücrelerin biyopsi edilmesi ayrı bir avantaj olup klivaj embriyolarındaki bu negatif faktör PGS in klinik başarısını da etkilemektedir. Polar body ve blastomer örnekleri ile yapılan PGT uygulamalarında başlangıç DNA’sının sınırlı olması dolayısıyla bu PCR hataları daha fazla görülmektedir. Trofektoderm biyopsisinde  daha fazla hücre kaynağı (5-7) ile çalışıldığından bu riskler azalmaktadır. Bu teknik avantajlarının yanı sıra blastokist aşamasında yapılan biyopsi gelişimsel olarak en seçkin embriyo ile çalışılıyor olması (kompetan embriyo) nedeniyle gebelik oranını artıracak ve aynı zamanda hasta başı daha az embriyo ile çalışılıyor olması dolayısıyla  PGS masrafını azaltacaktır. Şimdilerde non – invaziv PGD/PGS amaçlı blastosöl aspirasyonu gündeme gelmiştir. Real Time PCR ile Blastosöl sıvı örneklerinin %90’ında fetal genomik DNA saptanmıştır. Embriyonik hiçbir hücre alınmadan bu sıvı ICSI pipetle aspire edilebilmektedir. İnvaziv olmayan böylesi bir yöntem kulağa çok hoş gelmekle birlikte embriyo bulunmayan kültür medyumlarında bile DNA parçalarının tespit edilmiş olması bu yöntemde bir sınırlama olarak gündeme gelmiştir. Bu nedenle elde edilen bu DNA, embriyonun bütününü yansıtmayacaktır. Ayrıca bu DNA’nın dejenere ya da anormal hücrelerden salınıyor olması nedeniyle intakt hücrelerden salınanlar kadar iyi bir gösterge olmadığı tartışılmaktadır (4). Ayrıca tekniğin non invaziv olduğu söylense de aspirasyon sırasında embriyonun canlılığının düşebileceği şüphesi de oluşmuştur. Ancak bunca tartışmaya rağmen Palinin çalışması kulvarda bir çığır açmış ve cesaret verici bir çalışmadır (5).

Detaylı anöploidi taramasına olanak sağlayan teknikler arasında array CGH yaygın bir biçimde rutin uygulamalarda kullanılan ilk metottur. Genotipi bilinen hücrelerle detaylı bir validasyonu yapılmış ve dünya üzerinde yaygın bir biçimde kullanılmaktadır. Ticari olarak elde edilebilen ve rutin uygulamalarda yer almış Array CGH ürünlerinin başında 24 Sure mikroarrayleri (Illumina U.S.),  Agilent mikroarrayleri (Agilent Technologies, U.S.), Cytosure Embryo Screen Array (OGT 500040) ve RHS mikroarrayleri (Reproductive Health Science, Australia) gelmektedir. 24 kromozom taramaya yönelik bu array sistemlerinin genel çalışma prensipleri arasında farklılıklar olmakla birlikte tümü tüm genom amplifikasyonu sonrasında embriyonik DNA ile referans DNA’nın kontrol DNA’sı ile hibridizasyonu ile gerçekleşmektedir. Genetik uygulamalarda tarihi bir dönüm noktası olan yeni nesil sekanslama (Next Genration Sequencing –NGS) embriyolarda 24 kromozom tarama amaçlı olarak ta valide edilmiş ve rutin tedavilere girmiştir. NGS teknolojisinin array teknolojilerine olan avantajları: (i) yüksek ölçekli dizileme kapasitesi sayesinde aynı anda daha fazla örneğin (24 embriyo için) test edilebilmesine olanak sağlamakta ve daha düşük maliyetle çalışma imkanı vermektedir; (ii) kromozomal analiz rezolusyonunun yüksek olması sonucu parsiyel veya segmental anöploidileri daha iyi yakalamaktadır (birkaç megabaza kadar düşebilir); (iii) birden fazla hücrenin incelendiği çalışmalarda mozaisizmi daha net bir biçimde ortaya koymaktadır; (iv) kütüphane hazırlığı sırasındaki otomasyon satesinde insan hatalarını ve çalışma süresini azaltmaktadır (6). Tüm bu avantajları yanı sıra NGS il PGS teknolojilerinin FISH ve array tabanlı teknolojilerle ileri validasyonu bu tekniğin üreme genetiği uygulamalarındaki yerini güçlendirecektir.  Aynı zamanda dengesiz translokasyonların tespitinde NGS uygulaması ile ilgili çalışmaların yönü PGD uygulamalarında da önemli bir adım olacaktır.

 

Kaynaklar :

1 ) WiltonL.Preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening in early human embryos: a review.Prenat Diagn 2002;22:512–518.

2) Fragouli E, Lenzi M, Ross R, Katz-Jaffe M, Schoolcraft WB, Wells D. Comprehensive molecular cytogenetic analysis of the human blastocyst stage.Hum Reprod2008;23:2596–2608.

3) Johnson DS, Gemelos G, Baner J, Ryan A, Cinnioglu C, Banjevic M, Ross R, Alper M, Barrett B, Frederick J et al. Preclinical validation of a microarray method for full molecular karyotyping of blastomeres in a 24 h protocol. Hum Reprod 2010;25:1066–1075.

4) J. Cohen, G. Grudzinskas, and M. Johnson, “Embryonic DNAsampling without biopsy: the beginnings of non-invasive PGD?”ReproductiveBioMedicineOnline,vol.26,no.6,pp.520– 521,2013.

5) S. Palini, L. Galluzzi, S. de Stefani et al., “Genomic DNA in human blastocoele fluid,”Reproductive BioMedicine Online,vol. 26,no.6,pp.603–610,2013.

6) Francesco Fiorentino ,SaraBono, AnilBiricik, AndreaNuccitelli, EttoreCotroneo, GiulianoCottone, FelixKokocinski, Claude-EdouardMichel, MariaGiuliaMinasi andErmanno Greco. Applicationofnext-generation sequencingtechnologyfor comprehensiveaneuploidyscreening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles HumanReproduction,Vol.0,No.0pp.1–12,2014